Препаративные системы Препаративные сорбенты

Оборудование компании Varian. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

Системы линейного шкалирования Scale-Up

Идея линейного шкалирования (прямого масштабирования процесса аналитической хроматографии на препаративный уровень) Scal-Up была разработана фирмой Rainin и получила свое развитие после объединения с фирмой R&S Technology в нелинейную область. Шкалирование (Scale-Up) стало всеобъемлющим подходом в области препаративной жидкостной хроматографии, позволившим систематизировать и упорядочить все типы применяемых устройств.

Начиная разработку препаративного процесса наработки веществ, любой химик проводит аналитическую стадию – разделение смеси (сырья), содержащей интересующий компонент или компоненты, одним из типовых хроматографических способов: ТСХ, хроматография на открытых колонках, ВЭЖХ или хроматография среднего давления. Перенос этого процесса на более крупные масштабы подчиняется ряду правил и приводит к выбору одного из трех препаративных вариантов. В целом, если удовлетворительный вариант был получен на ТСХ или при хроматографии на открытых колонках, оптимальным препаративным способом будет или флэш-хроматография или Scale-Up#2. Если разработка метода начиналась с аналитической жидкостной хроматографии или ВЭЖХ, то логичным будет выбор между Scale-Up#1 или Scale-Up#2. Подбор оптимального режима и необходимого оборудования, в конце концов, определяется требованиями к уровню очистки и количественной наработки веществ, и может быть суммирован в таблице, приведенной в конце страницы.

Однако, для того чтобы более детально понять суть обоих методов Scale-Up (детали по флэш-хроматографии приведены отдельно), рассмотрим сравнение их основных параметров и суть принципов, лежащих в основе каждого подхода.

Сравнение методов Scale-Up

Сравнение методов Scale-Up

Scale-Up #1

1. Начните с разработанного аналитического метода. Сделайте Ваш первый «препаративный цикл» на аналитической колонке или колонке со слегка более крупным сорбентом. Используйте один и тот же «аналитический» сорбент (5-10 мкм) для аналитического и препаративного цикла. Соберите (очистите) все интересующие Вас пики.
2. Линейно, используя «фактор шкалирования», повысьте все шкалируемые параметры системы: площадь сечения (квадрат диаметра) колонки, объемную скорость потока, объем загружаемой пробы. Проведите препаративное разделение.

Преимущества Scale-Up #1

• Метод разрабатывается только один раз. Проводится прямое шкалирование одного оптимизированного режима на колонки любого диаметра.
• Минимизация риска потери образца
• Минимум сюрпризов
• Малая стоимость разработки и отладки

Линейное шкалирование – наиболее быстрый и эффективный способ препаративной хроматографии, оптимально подходящий для выделения нескольких компонентов из сложной смеси в сравнительно небольших количествах.

Что такое «фактор шкалирования» и почему он работает?

Линейный «фактор шкалирования» представляет собой отношение площадей сечения аналитической и препаративной колонки:

фактор шкалирования = R²_prep/R²_analytical

где R_prep и R_analytical - ID препаративной и аналитической колонки соответственно.

 Хроматографическое разделение происходит на частицах сорбента, которые «не знают», в какого диаметра колонке они находится. В том случае, если условия хроматографирования идентичны в масштабах одного зерна сорбента (линейная скорость потока, эффективность сорбции и диффузии, концентрационные соотношения и т.п.), то разделение компонентов будет идентично на колонках разных размеров. Линейный «фактор шкалирования» позволяет нам нормализовать препаративное разделение к аналитической хроматограмме. За исключением масштаба, аналитическое и препаративное разделение полностью идентичны. Если хроматограммы отличаются, это значит, что какие-то шкалируемые элементы не были нормализованы или какие-то абсолютные параметры были изменены.

Scale-up #2 – высокопроизводительный метод наработки и очистки веществ.

Упрощенный Scale-up #2

Размер и тип сорбента не изменяются, единственным отличием является переход в режим перегрузки колонки. Основная цель – сбор одного конкретного пика. Основной фокус – повышение коэффициента извлечения и производительности системы.

Максимизированный Scale-up #2

Осуществляется переход к более крупному сорбенту для уменьшения его стоимости (что, однако, влечет за собой уменьшение эффективности разделения). Повышается объем производства и снижается его себестоимость.

1. Начните с разработанного аналитического метода. Сделайте Ваш первый «препаративный цикл» на аналитической колонке с более крупным «препаративным» сорбентом (12-50 мкм), невысокой эффективности, подбирая его из соображений минимальной стоимости.
2. Оптимизируйте разделение в условиях перегрузки колонки. Сконцентрируйтесь на отборе одного пика, но, возможно, разделив («нарезав») его на несколько фракций. Проведите препаративное разделение после соответствующего масштабирования системы.

Преимущества Scale-Up #2

• После разработки метода он нелинейно шкалируется в условиях перегрузки для максимизации производительности и стоимостной эффективности процесса.
• Используются более крупные сорбенты меньшей стоимости.
• Возможно шкалирование в очень крупных промышленных масштабах
• Меньшая себестоимость продукции, чем при Scale-Up #1

Факторы, существенные при Scale-Up #2

• Селективность – это первый фактор, который следует принимать во внимание при оптимизации и шкалировании метода. Препаративный метод оптимизируется для повышения производительности и снижения стоимости, не из «эстетических соображений». Однако это не может служить оправданием для чрезвычайно плохой разрешающей способности колонки.
• Часто лимитирующим фактором производительности является растворимость образца. В связи с этим нельзя забывать о возможности проведения дополнительных исследований по растворимости образца с целью подбора правильной мобильной фазы.
• Изократический режим экономит растворитель и, зачастую, работает так же хорошо, как и градиентный (за исключением пептидов, белков и др.)
• Использование сорбентов с прямой фазой часто предпочтительно, так как это убирает необходимость в лиофилизации пробы.

Нелинейное шкалирование – способ быстрой и стоимостно эффективной наработки (очистки) большого количества вещества с высокой производительностью.

Требования к оборудованию, применяемому в обоих формах Scale-Up, отличны, хотя большинство модулей ProStar и PrepStar, производимых Varian, могут быть использованы в системах обоих типов.

Для Scale-Up #1 нужны модули, позволяющие работать как с малыми количествами веществ на аналитической стадии (чувствительность, Воспроизводимость времен удерживания и площадей пиков и т.п.), так и насосы, обеспечивающие высокие потки растворителей с большим давлением, необходимым для «продавливания» пробы сквозь широкие колонки, наполненные мелкозернистым сорбентом. Детектор должен быть совместим с большими величинами потоков элюента и обеспечивать как высокую чувствительность для аналитического режима, так и возможность работы с большими абсорбциями, характерными для режима перегрузки колонки. Существенным является возможность автоматизации ввода пробы, как малых (несколько мкл), так и больших (несколько мл) объемов.

При работе в режиме Scale-Up #2 нужны насосы, обеспечивающие высокую стабильность больших потоков, коллекторы фракций с возможностью сбора больших проб, автоматизированные контроллеры потоков, позволяющие перенаправлять собранную фракцию на повторное разделение (очистку), проводить рециркуляции растворителя и т.п. Концепция насосов со сменными модулями давления и рабочими головками на разные диапазоны потоков SD-1 и PS-218, детектор с ячейкой c двойным оптическим путем PS-320, флюид-процессор PS-530 идеально подходят для препаративных задач. Автосэмплер PS-410 позволяет вводить как малые, "аналитические", так и большие пробы (до 5 мл). Модуль подачи растворителя ProStar/PrepStar-218 обеспечивает поток до 200 мл/мин и давление 3500 psi. Он позволяет проводить препаративное разделение на колонках диаметром 41.4 мм (фактор шкалирования 280) и нарабатывать до 300 мг вещества за один цикл. Уникальный шприцевой насос SD-1 расширяет диапазон рабочих потоков до 3200 мл/мин и давления – до 10000 psi (685 Атм), что позволяет использовать его для наработок 4-5 г. вещества за один цикл (колонки 150 мм, фактор шкалирования 1060) в прямом линейном шкалировании Scale-Up #1, и более – в режиме нелинейной перегрузки Scale-Up #2. Серия PrepStar, поставляемая как в виде отдельных модулей, так и готовых комплектных систем, рассчитана, в основном, на форму линейного препаративного шкалирования, системы SepTech на базе насосов SD-1, SD-2 и процессора потоков PS-530, в основном, сориентированы на нелинейное шкалирование Scale-Up #2.

Для решения одной из основных проблем препаративной хроматографии – появления мертвого объема за счет разрушения сорбента в процессе хроматографирования – Varian выпускает колонки Dynamax и Load&Lock  с динамической или статической аксиальной компрессией. Колонки поставляются как отдельно, так и в комплекте со станциями набивки RamPak или L&L

Не последнюю роль в реализации различных форм Scale-Up играет программное обеспечение, В одном случае оно должно совмещать аналитический количественный пакет с системами электронный безопасности по GLP/GMP. Такм пактом является Star WS версии 6. В другом варианте ПО должно полностью отвечать требованиям документации процессов по GMP и быть достаточно удобным для работающих с ПО не-хроматографистов (инженеров-производственников, операторов средней квалификации и т.п.) Для таких целей идеально подходит пакет LC ReSponder.

Рекомендованное оборудование для разных типов препаративной хроматографии

Сводя воедино, все сказанное выше, подбор препаративной системы можно свести к следующей таблице:

Вернуться

На главную страницу

Дополнительная информация:

E-mail: info@fizlabpribor.ru Тел.(095)740-5406