Препаративные системы Препаративные сорбенты

Оборудование компании Varian. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

Системы линейного шкалирования Scale-Up

Идея линейного шкалирования (прямого масштабирования процесса аналитической хроматографии на препаративный уровень) Scal-Up была разработана фирмой Rainin и получила свое развитие после объединения с фирмой R&S Technology в нелинейную область. Шкалирование (Scale-Up) стало всеобъемлющим подходом в области препаративной жидкостной хроматографии, позволившим систематизировать и упорядочить все типы применяемых устройств.

Начиная разработку препаративного процесса наработки веществ, любой химик проводит аналитическую стадию – разделение смеси (сырья), содержащей интересующий компонент или компоненты, одним из типовых хроматографических способов: ТСХ, хроматография на открытых колонках, ВЭЖХ или хроматография среднего давления. Перенос этого процесса на более крупные масштабы подчиняется ряду правил и приводит к выбору одного из трех препаративных вариантов. В целом, если удовлетворительный вариант был получен на ТСХ или при хроматографии на открытых колонках, оптимальным препаративным способом будет или флэш-хроматография или Scale-Up#2. Если разработка метода начиналась с аналитической жидкостной хроматографии или ВЭЖХ, то логичным будет выбор между Scale-Up#1 или Scale-Up#2. Подбор оптимального режима и необходимого оборудования, в конце концов, определяется требованиями к уровню очистки и количественной наработки веществ, и может быть суммирован в таблице, приведенной в конце страницы.

Однако, для того чтобы более детально понять суть обоих методов Scale-Up (детали по флэш-хроматографии приведены отдельно), рассмотрим сравнение их основных параметров и суть принципов, лежащих в основе каждого подхода.

Сравнение методов Scale-Up

Scale-up #1	Scale-up #2
Аналитическое линейное масштабирование	Высокопроизводительное нелинейное масштабирование
Основные характеристики:
Крупномасштабное разделение «аналитического» типа	Разделение в режиме перегрузки колонки
Меньшая чувствительность к стоимости оборудования или продукта	Определяющий фактор – себестоимость нарабатываемого продукта
Необходима большая эффективность (разрешающая способность)	Эффективность не столь важна как селективность
Большая ориентация на анализ и обработку данных	Большая ориентация на документацию процесса
Наиболее быстрое и прямое арифметическое масштабирование. Не требуется дополнительная отладка метода в препаративных масштабах, поскольку предсказуемость получаемого результата очень высока.	Требуется дополнительная отладка метода. Основные варьируемые параметры – размер сорбента и режим перегрузки колонки
Сфера применения:
Разработка методов	Клинические исследования
Исследования и разработки	Разработка процессов
Преклинические испытания в малых объемах	Промышленная наработка веществ
Требования к оборудованию:
Низкие потоки, высокое давление	Высокие потоки
Точность потока	Необходимо сочетание высоких потоков и высокого давления
Воспроизводимость потока	Воспроизводимость потока
Мелкозернистый сорбент (большее давление)	Крупнозернистый сорбент (меньшее давление)
Небольшие колонки	Большие колонки
Небольшой объем пробы	Большие пробы
«Шкалируемое» разделение (идентичность аналитической и препаративной хроматограмм)	Режим перегрузки колонки. Ресайклинг растворителя
Пользователи:
Аналитические химики	Медицинские или органические химики
Химики-органики (синтетики)	Биохимики (лабораторные)
	Промышленные инженеры (биопроцессы и промышленные процессы)

Сравнение методов Scale-Up

Scale-Up #1

1. Начните с разработанного аналитического метода. Сделайте Ваш первый «препаративный цикл» на аналитической колонке или колонке со слегка более крупным сорбентом. Используйте один и тот же «аналитический» сорбент (5-10 мкм) для аналитического и препаративного цикла. Соберите (очистите) все интересующие Вас пики.
2. Линейно, используя «фактор шкалирования», повысьте все шкалируемые параметры системы: площадь сечения (квадрат диаметра) колонки, объемную скорость потока, объем загружаемой пробы. Проведите препаративное разделение.

Преимущества Scale-Up #1

• Метод разрабатывается только один раз. Проводится прямое шкалирование одного оптимизированного режима на колонки любого диаметра.
• Минимизация риска потери образца
• Минимум сюрпризов
• Малая стоимость разработки и отладки

Линейное шкалирование – наиболее быстрый и эффективный способ препаративной хроматографии, оптимально подходящий для выделения нескольких компонентов из сложной смеси в сравнительно небольших количествах.

Что такое «фактор шкалирования» и почему он работает?

Линейный «фактор шкалирования» представляет собой отношение площадей сечения аналитической и препаративной колонки:

фактор шкалирования = R²_prep/R²_analytical

где R_prep и R_analytical - ID препаративной и аналитической колонки соответственно.

 Хроматографическое разделение происходит на частицах сорбента, которые «не знают», в какого диаметра колонке они находится. В том случае, если условия хроматографирования идентичны в масштабах одного зерна сорбента (линейная скорость потока, эффективность сорбции и диффузии, концентрационные соотношения и т.п.), то разделение компонентов будет идентично на колонках разных размеров. Линейный «фактор шкалирования» позволяет нам нормализовать препаративное разделение к аналитической хроматограмме. За исключением масштаба, аналитическое и препаративное разделение полностью идентичны. Если хроматограммы отличаются, это значит, что какие-то шкалируемые элементы не были нормализованы или какие-то абсолютные параметры были изменены.

Scale-up #2 – высокопроизводительный метод наработки и очистки веществ.

В Scale-up #2 встречаются две разновидности метода:
(в отличие от Scale-up #1, где разделение проводится в прямом масштабе и собирается более одной фракции элюента).

Упрощенный Scale-up #2

Размер и тип сорбента не изменяются, единственным отличием является переход в режим перегрузки колонки. Основная цель – сбор одного конкретного пика. Основной фокус – повышение коэффициента извлечения и производительности системы.

Максимизированный Scale-up #2

Осуществляется переход к более крупному сорбенту для уменьшения его стоимости (что, однако, влечет за собой уменьшение эффективности разделения). Повышается объем производства и снижается его себестоимость.

1. Начните с разработанного аналитического метода. Сделайте Ваш первый «препаративный цикл» на аналитической колонке с более крупным «препаративным» сорбентом (12-50 мкм), невысокой эффективности, подбирая его из соображений минимальной стоимости.
2. Оптимизируйте разделение в условиях перегрузки колонки. Сконцентрируйтесь на отборе одного пика, но, возможно, разделив («нарезав») его на несколько фракций. Проведите препаративное разделение после соответствующего масштабирования системы.

Преимущества Scale-Up #2

• После разработки метода он нелинейно шкалируется в условиях перегрузки для максимизации производительности и стоимостной эффективности процесса.
• Используются более крупные сорбенты меньшей стоимости.
• Возможно шкалирование в очень крупных промышленных масштабах
• Меньшая себестоимость продукции, чем при Scale-Up #1

Факторы, существенные при Scale-Up #2

• Селективность – это первый фактор, который следует принимать во внимание при оптимизации и шкалировании метода. Препаративный метод оптимизируется для повышения производительности и снижения стоимости, не из «эстетических соображений». Однако это не может служить оправданием для чрезвычайно плохой разрешающей способности колонки.
• Часто лимитирующим фактором производительности является растворимость образца. В связи с этим нельзя забывать о возможности проведения дополнительных исследований по растворимости образца с целью подбора правильной мобильной фазы.
• Изократический режим экономит растворитель и, зачастую, работает так же хорошо, как и градиентный (за исключением пептидов, белков и др.)
• Использование сорбентов с прямой фазой часто предпочтительно, так как это убирает необходимость в лиофилизации пробы.

Нелинейное шкалирование – способ быстрой и стоимостно эффективной наработки (очистки) большого количества вещества с высокой производительностью.

Требования к оборудованию, применяемому в обоих формах Scale-Up, отличны, хотя большинство модулей ProStar и PrepStar, производимых Varian, могут быть использованы в системах обоих типов.

Для Scale-Up #1 нужны модули, позволяющие работать как с малыми количествами веществ на аналитической стадии (чувствительность, Воспроизводимость времен удерживания и площадей пиков и т.п.), так и насосы, обеспечивающие высокие потки растворителей с большим давлением, необходимым для «продавливания» пробы сквозь широкие колонки, наполненные мелкозернистым сорбентом. Детектор должен быть совместим с большими величинами потоков элюента и обеспечивать как высокую чувствительность для аналитического режима, так и возможность работы с большими абсорбциями, характерными для режима перегрузки колонки. Существенным является возможность автоматизации ввода пробы, как малых (несколько мкл), так и больших (несколько мл) объемов.

При работе в режиме Scale-Up #2 нужны насосы, обеспечивающие высокую стабильность больших потоков, коллекторы фракций с возможностью сбора больших проб, автоматизированные контроллеры потоков, позволяющие перенаправлять собранную фракцию на повторное разделение (очистку), проводить рециркуляции растворителя и т.п. Концепция насосов со сменными модулями давления и рабочими головками на разные диапазоны потоков SD-1 и PS-218, детектор с ячейкой c двойным оптическим путем PS-320, флюид-процессор PS-530 идеально подходят для препаративных задач. Автосэмплер PS-410 позволяет вводить как малые, "аналитические", так и большие пробы (до 5 мл). Модуль подачи растворителя ProStar/PrepStar-218 обеспечивает поток до 200 мл/мин и давление 3500 psi. Он позволяет проводить препаративное разделение на колонках диаметром 41.4 мм (фактор шкалирования 280) и нарабатывать до 300 мг вещества за один цикл. Уникальный шприцевой насос SD-1 расширяет диапазон рабочих потоков до 3200 мл/мин и давления – до 10000 psi (685 Атм), что позволяет использовать его для наработок 4-5 г. вещества за один цикл (колонки 150 мм, фактор шкалирования 1060) в прямом линейном шкалировании Scale-Up #1, и более – в режиме нелинейной перегрузки Scale-Up #2. Серия PrepStar, поставляемая как в виде отдельных модулей, так и готовых комплектных систем, рассчитана, в основном, на форму линейного препаративного шкалирования, системы SepTech на базе насосов SD-1, SD-2 и процессора потоков PS-530, в основном, сориентированы на нелинейное шкалирование Scale-Up #2.

Для решения одной из основных проблем препаративной хроматографии – появления мертвого объема за счет разрушения сорбента в процессе хроматографирования – Varian выпускает колонки Dynamax и Load&Lock  с динамической или статической аксиальной компрессией. Колонки поставляются как отдельно, так и в комплекте со станциями набивки RamPak или L&L

Не последнюю роль в реализации различных форм Scale-Up играет программное обеспечение, В одном случае оно должно совмещать аналитический количественный пакет с системами электронный безопасности по GLP/GMP. Такм пактом является Star WS версии 6. В другом варианте ПО должно полностью отвечать требованиям документации процессов по GMP и быть достаточно удобным для работающих с ПО не-хроматографистов (инженеров-производственников, операторов средней квалификации и т.п.) Для таких целей идеально подходит пакет LC ReSponder.

Рекомендованное оборудование для разных типов препаративной хроматографии

Scale-up #1	Scale-up #2
Аналитическое линейное масштабирование Оптимальная конфигурация:	Высокопроизводительное нелинейное масштабирование Оптимальная конфигурация:
Насос SD-1 (200/500мл) или два насоса	Насос SD-2 (200/800 мл) LPG (градиент низкого давления) или два насоса
ПО Star WS	ПО LC ReSponder + PrepStar 530
Оптимальная комбинация динамического диапазона потока и давления	Оптимальное сочетание возможностей и стоимости оборудования
Альтернативный вариант (экономная конфигурация):
Насос 218 (50/100/200 мл)	Насос 218 (200 мл)
ПО Star WS	ПО LC ReSponder или Star WS, если стоимость оборудования является решающим фактором
Колонки: Dynamax 1” + RamPak	Колонки: Load & Lock
Опция: ПО LC ReSponder и PrepStar 530
Компьютерный интерфейс и процессор потоков PrepStar 530
ПО LC ReSponder
Дополнительные входы (до 8 входов; 4 канала A and 4 канала B)
Компьютер с ОС Windows NT или Pro 2000

Сводя воедино, все сказанное выше, подбор препаративной системы можно свести к следующей таблице:

Аналитический метод	Загрузка пробы	Тип пробы	Требуемая производительность	Вариант препаратива
				Формат	Оборудование
ВЭЖХ	мг -> г	Очень сложная	низкая	Scale-Up #1 (линейный)	SD-1 или PrepStar 218 с ПО Star WS
ТСХ или открытые колонки	мг -> 10 г	простая	низкая	Флэш	Chroma..Zone, MetaFlash или Bond ElutFlush
ТСХ или ВЭЖХ	мг -> кг	сложная	высокая	Scale-Up #2 (перегруз)	SD-2 с ПО LC ReSponder
ВЭЖХ	г -> несколько кг	сложная	высокая	Scale-Up #2 (перегруз)	«Скид» ВЭЖХ или Био-ЖХ (среднего давления) системы с ПО LC ReSponder

---

Вернуться

На главную страницу

Дополнительная информация:

E-mail: info@fizlabpribor.ru Тел.(095)740-5406