Применение ВЭЖХ для биологических разделений -
перспективная и бурно развивающаяся область.
За последние 10 - 15 лет, в связи с появлением сверхчистого силикагеля и технологий
устранения активных силанольных групп, появилась возможность использовать
обращенно-фазную ВЭЖХ для аналитического и препаративного разделения
белков, нуклеиновых кислот и подобных соединений.
Ранее денатурация биомолекул и/или низкий выход тормозили работу в этой области.
Колонки для биохроматографии
отличаются от обычных ВЭЖХ колонок или увеличенным размером пор для больших молекул, или
химическим составом, позволяющим использовать элюенты для биомолекулярной химии, типа TFA.
При исследовании зависимости времени удержания аналита от содержания (%) в элюенте
органического растворителя обнаружено интересное различие поведения небольших органических молекул от поведения протеинов.
Небольшие органические молекулы удерживаются / элюируют в соответствии с распределительным механизмом разделения,
на что указывает линейная зависимость времени удержания от содержания растворителя. Наоборот, для пептидов и протеинов эта зависимость
существенно нелинейная и может быть объяснена адсорбционным механизмом. Поэтому в этом случае важно тщательно изучить влияние
размера пор, который будет иметь ключевое значение для разрешения и выхода при
разделении пептидов и протеинов.
Влияние размера пор на разделение пептидов и протеинов
Результаты исследований влияния размера пор на разделение пептидов и протеинов приведены в таблице слева.
Как показано в таблице слева, колонка C18 с порами размером 12 nm подходит для маленьких
пептидов весом до 5000 Дальтон. Для разделения больших пептидов и маленьких протеинов
наиболее эффективна фаза C8 с порами размером 20 nm. Большинство протеинов эффективно элюируется на колонке C4 с порами размером 30 nm.
Однако, на разделение может влиять также гидрофобность пептидов / протеинов и природа привитой фазы.
Поэтому приведенную информацию следует рассматривать как начальный шаг оптимизации.
Для протеинов и пептидов с молекулярной массой от 4 300 до 17 000 Дальтон, исследуются
характеристики разделения в зависимости от с размера пор и функциональной группы
колонки. В соответствии с таблицей, приведенной выше лучше всего для этого интервала масс подходит колонка C8 с порами размером 20 nm.
Для колонок с другим размером пор или другой функциональной группой будет иметь место размытие пика или низкий выход.
При использовании фазы C8, 20 nm, как показано на рисунках ниже, получаются
наилучшие результаты
Cytochrome c (MW: 12,400)
Insulin (MW: 5,700)
Amyloid β-protein (MW: 4,300)
Lysozyme (MW: 14,400)
a-Lactalbumin (MW: 14,200)
Myoglobin (MW: 17,000)
Колонка: 150 x 4.6 mm i.d. 5µm
Элюент:
A)Вода/TFA (100/0,1)
B)ACN/TFA( 100/0,1)
Скорость потока: 1.0 ml/min Температура: 37° C Детектор: UV at 220
nm
Применение
Колонки YMC для биохроматографии это обращенно-фазные колонки с размером пор 20 или 30 nm,
с функциональной группой C18, C8, C4 что позволяет подобрать оптимальный размер пор и стационарную фазу.
Интересную альтернативу представляют колонки YMC-Pack Protein-RP с другой селективностью и стабильностью к TFA
Для анализа полисахаридов, гликопротеинов, нуклеиновых кислот и сходных соединений альтернативой стандартным амино колонкам
является YMC-Pack Polyamine II - амино фаза на полимерной основе.
Олигонуклеотиды
c-Ha-ras/12 (20 mer)
GTGGGCGCC-AGC-GGTGTGGG
Ser
c-Ha-ras/12 (20 mer)
GTGGGCGCC-GCC-GGTGTGGG
Ala
c-Ha-ras/12 (20 mer)
GTGGGCGCC-GAC-GGTGTGGG
Asp
c-Ha-ras/12 (20 mer)
GTGGGCGCC-GTC-GGTGTGGG
Val
c-Ha-ras/12 (20 mer)
GTGGGCGCC-CGC-GGTGTGGG
Arg
Колонка:
YMC-Pack C4 5µm, 30 nm, 150 x 4.6 mm i.d.
Элюент:
A) 100 mM Triethylamine-acetic acid (pH 6.5) / acetonitrile (94/6)
B) 100 mM Triethylamine-acetic acid (pH 6.5) / acetonitrile (85/15)
0%-100% B (0-25 min., linear)
Скорость потока:
1.0 ml/min
Температура:
30° C
Детектор:
UV at 260 nm
Протеины
</td>
Ribonuclease A
Cytochrome c
Lysozyme
Myoglobin
Колонка:
YMC-Pack C4 5µm, 30 nm, 150 x 4.6 mm i.d.
Элюент:
A) acetonitrile / water / TFA (5/95/0.1)
B) acetonitrile / water / TFA (60/40/0.1)
30%-90% B (0-20 min., linear), 90% B (20-50 min)
Скорость потока:
1.0 ml/min
Температура:
37° C
Детектор:
UV at 220 nm
Колонки
YMC с широкими порами также подходят для анализа соединений с большой
гидрофобностью. На хроматограммах ниже сравнивается удержание алкилбензолов на
сорбенте YMC-Pack ODS-A с разным размером пор. Соединения с большей гидрофобностью элюируются
быстрее на YMC-Pack ODS-A 30 nm чем на ODS-A 12 nm.
Для соединений с высокой гидрофобностью
Колонка:
YMC-Pack ODS-A 5µm, 12 nm, YMC-Pack ODS-A 5µm, 30 nm 150 x 4.6 mm i.d.
Колонки
для биохроматографии YMC
/td>
