Проведена работа по тестированию ВЭЖХ сорбентов от разных производителей. Сорбенты были упакованы в стальные колонки с внутренним диаметром 10 мм и длиной 250 мм (объём сорбента в колонке CV = 19,63 мл). Были проверены следующие хроматографические колонки с модифицированным сферическим силикагелем: YMC basiс и YMC-Triart Prep C8-L, производства компании YMC (Япония), а также колонки D (производитель D) и K (производитель A).
Работа проводилась младшим научным сотрудником Киевского института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии, ведущим специалистом ЧАО «ИНДАР» В.Р. Луцивым на жидкостном хроматографе «Gilson» с использованием насосов № 305, 306, манометрического модуля № 808, динамического миксера № 811С, UV/VIS детектора № 112. Анализ полученного инсулина проводили на аналитическом ВЭЖХ хроматографе «Waters» в лаборатории физико-химического анализа ЧАО «ИН-ДАР» и на аналитическом хроматографе Agilent 1200 в институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии.
Скорость подвижной фазы во всех опытах 1,96 мл/мин (2,5 см/мин). Для элюции инсулина использовали линейный градиент по органическому модификатору с крутизной 0,1 % в минуту. Время выхода пика инсулина от 40 до 50 мин подбирали для каждой колонки индивидуально. В качестве образца во всех опытах использовали инсулин человека рекомбинантный «сырец» с чистотой 96,5 %, который был предварительно очищен при помощи ионно-обменной хроматографии на SP-Toyopearl 650S. Нагрузка во всех опытах составила 330 ± 1 мг по технической массе (308,6 мг в пересчёте на сухое вещество).
В таблице № 1 представлены усреднённые результаты по каждой из колонок.
| Таблица № 1 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| № | Наименование колонки | Выход по инсулину, % | Содержание инсулина, % | Содержание дезамидо (А21)-инсулина, % | Содержание прочих примесей, % | Обратимость сорбции, % |
| 1 | YMC basic | 92,5 | 99,02 | 0,15 | 0,83 | 97,9 |
| 2 | YMC-Triart Prep C8-L | 92,6 | 99,16 | 0,16 | 0,68 | 98,6 |
| 3 | Колонка D | 82,1 | 98,90 | 0,16 | 0,94 | 95,9 |
| 4 | Колонка K | 89,6 | 98,93 | 0,26 | 0,81 | 98,1 |
Как видно из таблицы, для сорбента YMC basic выход составил 92,5 %, для сорбента YMC-Triart Prep C8-L -92,6 %, для сорбента K - 89,6 %, для сорбента D – 82,1 %. Использование сорбентов YMC-Triart Prep C8-L и YMC basic обеспечивают более высокий выход по инсулину и лучшее качество инсулина.
На заключительном этапе работы была поставлена серия опытов по определению срока эксплуатации тестируемых сорбентов. Для этого каждый из сорбентов подвергался многократным циклам очистки инсулина с последующей регенерацией сорбента в колонке.
При эксплуатации и регенерации сорбента с силикагелем происходят необратимые изменения, связанные с разрушением частиц сорбента и, вероятно, потерей части привитой фазы. По этой причине повышается давление на хроматографической колонке, усиливается неспецифическая адсорбция, меняется селективность.
Следует отметить, что при реальной промышленной эксплуатации сорбентов регенерацию 0,05 М раствором NaOH в 50 % ацетонитриле проводят не после каждого цикла очистки инсулина, а после 30 – 40 циклов очистки. При этом принимается во внимание информация о давлении на колонке и качестве очистки инсулина. Таким образом можно с высокой вероятностью прогнозировать реальное количество циклов очистки инсулина и затраты на очистку, связанные с периодической заменой сорбента. При расчётах принималось во внимание, что регенерацию 0,05 М раствором NaOH в 50 % ацетонитриле проводят после 35 циклов очистки инсулина, а нагрузка по инсулину составляет 15 мг на 1 мл сорбента. В таблице № 2 показаны результаты таких расчётов.
| Таблица № 2 | ||||
|---|---|---|---|---|
| № | Наименование сорбента | Количество циклов очистки | Выход по инсулину с рехроматографией боковых фракций, % | Количество полученного инсулина на 1 кг (1,667 л) сорбента, кг |
| 1 | YMC basic | 140 | 97,0 | 3,396 |
| 2 | D | 105 | 94,9 | 2,492 |
| 3 | K | 210 | 96,0 | 5,041 |
| 4 | YMC-Triart Prep C8-L | 420 | 97,3 | 10,219 |
Таким образом, максимальное количество инсулина будет получено при использо-вании сорбента YMC-Triart Prep C8-L. Также хороший результат показали сорбенты K и YMC basic. Сорбент D существенно уступает сорбентам YMC-Triart Prep C8-L, K и YMC basic.
Следует отметить, что количество полученного инсулина с 1 кг сорбента не в полной мере отражает экономическую целесообразность применения того или иного сорбента. Для правильного выбора следует учитывать все затраты, связанные с ВЭЖХ очисткой инсулина: затраты на сорбент, затраты на подвижную фазу и затраты на инсулин «сырец».
Расчеты с учетом этих факторов показывают, что при использовании YMC-Triart Prep C8-L затраты на получение 1 кг инсулина ниже, чем при использовании сорбентов D, K и YMC basic. €. Сорбенты K и YMC basic тоже могут быть с успехом использованы в производстве инсулина, но с меньшим экономическим эффектом.