Гидрофобная хроматография (HIC) широко используется для очистки и разделения таких биомолекул как белки и пептиды. Гидрофобная хроматография сортирует биомолекулы по степени гидрофобности их поверхности. Образцы адсорбируются на смоле при относительно высоких концентрациях соли и элюируются применением убывающего по соли градиента. Мягкие условия, используемые в методе гидрофобной хроматографии, как правило, сохраняют структуру и биологическую активность белков, что делает HIC мощным инструментом для очистки биомолекул.

При подборе метода HIC нужно обеспечить высокую динамическую связывающую емкость (DBC), подходящую селективность, хороший выход и сохранение биологической активности. В первую очередь это достигается выбором наилучшего сорбента для даного разделения. Белки имеют различную гидрофобность в зависимости от их аминокислотного состава, структуры и размера. Поэтому для оптимального разделения необходимо подобрать подвижную фазу и сорбент. Соответствие гидрофобность целевого соединения и гидрофобности сорбента имеет решающее значение для качества и эффективности очистки.

Семь линеек сорбентов Toyopearl для гидрофобной хроматографии (HIC) обеспечивают высокую селективность к белкам, основанную на гидрофобности их поверхности. Мягкие, не денатурирующие характеристики HIC сорбентов позволяют сохранить высокий уровень активности белков. Пять различных лигандов представляют полный спектр селективности для оптимизации удерживания, разрешения и выхода белков. Различный размер пор позволяет оптимизировать динамическую емкость для индивидуальных целевых белков.

Рекомендации по применению:

Для белков с низкой гидрофобностью нужно использовать более гидрофобный сорбент и наоборот. Сорбенты Butyl-600, PPG-600 и Phenyl-600 оптимизированы для очистки mAb, сочетая очень высокую динамическую связывающую емкость (DBC) с высоким выходом.

Адсорбционная емкость
Сорбент	Размер пор	Лизоцим (мг/мл сорбента)	Другие белки (мг/мл)	Спецификация (на английском)
Ether-650 (S,M)	1,000 Å	10-301)	-
PPG-600M	750 Å	45-551)	mAb (Anti-LH): > 302)
Phenyl-650 (S,M,C)	1,000 Å	30-501)	mAb (Anti-LH): > 302)
Butyl-600M	750 Å	-	mAb (Anti-LH): > 502)
Butyl-650 (S,M,C)	1,000 Å	401), 402)	h-mAb: ≈40
SuperButyl-550C	750 Å	30-501), 612)	-
Hexyl-650C	500 Å	30-501)	-
Phenyl-600M	1,000 Å	601)	h-mAb: > 501)
1)Статическая
2) Динамическая (10% до проскока)

•Гидрофобная хроматография TOSOH (брошюра, англ.)

Ионно-обменная хроматография удерживает молекулы ионным взаимодействием. Ионые функциональные группы на поверхности стационарной фазы взаимодействуют с противоположно заряженными ионами аналита. В соответствии с этим ионно-обменная хроматография подразделяется на катионно-обменую и анионно-обменую хроматографию. Анионообменники несут положительно заряженные группы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными анионами. Катионообменные смолы имеют отрицательно заряженные группы, которые взаимодействуют с положительно заряженными катионами. Заряженные целевые молекулы "закрепляются" на неподвижной фазе, но при увеличении концентрации ионов того же заряда что и анализируемые или целевые ионы, будут вытесняться из неподвижной фазы.

Белки имеют много как положительно, так и отрицательно заряженных функциональных групп. Ионно-обменная хроматография разделяет белки в соответствии с их средним поверхностным зарядом, который зависит от рН и ионной силы подвижной фазы. Соотношение между средним поверхностным зарядом и рН уникально для каждого конкретного белка. В изоэлектрической точке pI (соответствует pH, при котором молекула не имеет среднего электрического заряда) белок не взаимодействует со стационарной фазой. При рН выше pI белок имеет отрицательный средний заряд и взаимодействует с положительно заряженным анионитом. При рН ниже pI заряд белка положительный, и, следовательно, он будет взаимодействовать с отрицательно заряженным катионообменником. Изменяя рН или концентрацию соли в подвижной фазе можно оптимизировать разделение.

Ионообменная хроматография наиболее часто используемый в производстве биофармацевтической промышленности метод жидкостной хроматографии. Ионообменные сорбенты Toyopearl имеют преимущественно базовые матрицы HW-65 или HW-55. Благодаря высокой проницаемости сорбентов достигается быстрое уравновешивание по рН или ионной силе, обычно достаточно всего трех колоночных объемов.

Рекомендации по применению:

Все сорбенты могут использоваться для рекомбинантных и мембранных белков. SP-650, CM-650, NH2-750F для mAbs, DEAE-650, GigaCap DEAE-650 M для белков плазмы и нуклеиновых кислот, SuperQ оптимизированы для белков с молекулярной массой <50 kDa. MegaCap II, SP-550, Q-600C AR и, особенно, GigaCap S, Q, CM и DEAE имеют высокую динамическую емкость и обеспечивают высокую скорость потока для концентрирования разбавленных производственных растворов.

Адсорбционная емкость
	GigaCap Q-650	Super Q-650	DEAE-650	QAE-550	Q-600C AR	GigaCap S-650	MegaCap II SP-550	SP-550	SP-650	GigaCap CM-650	CM-650
BSA	>1601) >1502)	≈1452)	≈252)	701) 302)	>1201) ≈1002)	-	-	-	-	-	-
Lysozyme	-	-	-	-	-	>2001)	≈702)	1101) 702)	501) 352)	381) 352)	352)
mAb	1082)	132)	≈312)	322)	902)	1501) 1452)	-	142)	122)	>1101) ≈1002)	-
Insulin	-	-	-	-	-	≈1402)	>1001) ≈802)	≈802)	≈502)	-	-

•Ионно-обменная хроматография TOSOH (брошюра, англ.)

Все молекулы, в том числе и белки, имеют сложную трехмерную структуру. Аффинная хроматография использует лиганды, способные распознавать один из структурных фрагментов молекулы. Лиганд может взаимодействовать только с одним типом молекулы или распознавать группу структурно подобных молекул. В идеале леганд на твердой подложке должен хорошо связывать целевые молекулы. Однако, слишком сильное связывание может затруднить десорбцию из колонны. Если в качестве аффинного лиганда используется пептид или белок, то надо обеспечить сохранение его структуры в процессе очистки.

Высокая селективность делает аффинную хроматографию мощным инструментом выделения и очистки белков. Одно из наиболее известных приложений для афинной хроматографии - очистка моноклональных антител. Она так же используется для аналитики, но не так широко как в препаративной и промышленной хроматографии.

Аффинные сорбенты Toyopearl – механически стабильны, показывают высокую рН стабильность и высокую концентрацию лигандов. Активированные сорбенты поставляются в виде лиофилизированных порошков (1г/4 мл геля), в то время как реакционноспособные и готовые к употреблению сорбенты поставляются в виде набухших гелей.

Реакционноспособные сорбенты		Размер пор
AF-Amino-650M		1,000 Å
AF-Carboxy-650M		1,000 Å
AF-Formyl-650M		1,000 Å
Активированные сорбенты		Размер пор
AF-Epoxy-650M		1,000 Å
AF-Tresyl-650M		1,000 Å
Готовые к употреблению сорбенты		Размер пор
AF-Chelate-650M		1,000 Å
AF-HeparinHC-650M		1,000 Å
AF-Red-650ML		1,000 Å
AF-rProtein A-650F		1,000 Å
AF-rProtein A HC-650F		1,000 Å
M = 65 мкм, ML = 65 мкм, F = 45 мкм

Рекомендации по применению:

Epoxy-650 легко образует стабильную эфирную связь для малых лигандов, Tresyl-650 рекомендуется для прямой пришивки белков в мягких условиях. Реакционноспособные Amino, Carboxy или Formyl-650 иммобилизуют эфиры белков или малые лиганды с помощью карбодиимидного метода или метода восстановительного алкилирования. Red-650 полезен для очистки нуклеотид-зависимых ферментов. Chelate-650 может использоваться в IMAC-методе для очистки гистидин-меченных белков. HeparinHC-650 связывается с широким рядом компонентов плазмы, таких как ДНК полимераза, Факторы VIII иd IX. AF-rProtein A-650F и AF-rProtein A HC-650F могут использоваться для очистки иммуноглобулинов и моноклональных антител (mAbs).

•Аффинный сорбент TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F

Гельхроматография (Size exclusion chromatography, SEC) разделяет молекулы по их размеру, или, точнее, по их эффективному гидродинамическому объему. Гельхроматография обычно применяется к большим молекулам, таким как белки или синтетические полимеры.

Если применяется органический растворитель, то часто говорят гель-проникающей хроматографии. Гель-проникающая хроматография, как правило, используется для определения молекулярной массы и распределения по массе синтетических полимеров

Если используется водная подвижная фаза то говорят о гель-фильтрации. Благодаря эффективности и неденатурирующим условиям, SEC с водным элюентом является эффективным методом для разделения и очистки на основе размера белков и биополимеров. Основой стационарных фаз для SEC с водным элюентом могут служить как мягкие материалы, такие как как декстран или агароза, так и материалы с высокой механической прочностью, применяемые в ВЭЖХ: гидрофильные полимеры и пористый силикагель

Сорбенты Tosoh Toyopearl для SEC разделяют молекулы в соответствии с их физическим размером. Они идеальны для фракционирования комплексных образцов, замены буфера или для финальной стадии очистки.

Рекомендации по применению:

HW-40: фракционирование низкомолекулярных компонентов или замена буфера; HW-50: для пептидных фрагментов; HW-55, HW-65: для белков; HW-75: для больших нуклеиновых кислот или плазмидных ДНК. Сорбенты HW прекрасно подходят для разделения олигосахаридов или гликозилированных белков.

•Эксклюзионная хроматография (SEC) TOSOH (брошюра, англ.)

•Сорбент для мульти модальной хроматографии TOSOH MX-Trp-650M (брошюра, англ.)

---

О компании

Дополнительная информация:

E-mail: info@fizlabpribor.ru

Тел.+7 (925) 740-5406

Факс/Тел.+7 (495) 9-888-725

 

	Компания Физлабприбор открыла свою страничку в Instagram!
	https://www.instagram.com/fizlabpribor/
	Будем рады видеть Вас в рядах наших подписчиков.