| Продукция компании TOSOH |
|
TOSOH BIOSCIENCE
О КОЛОННАХ TSKgel, ОБРАЩЕНИИ С НИМИ И МАСШТАБИРОВАНИИ
TOSOH BIOSCIENCE
О КОЛОННАХ TSKgel, ОБРАЩЕНИИ С НИМИ И МАСШТАБИРОВАНИИ
Корпорация Tosoh Bioscience тщательно контролирует все стадии производства хроматографических сорбентов, которыми потом заполняются колонны TSKgel. Сорбенты производятся большими партиями, которые подвергаются строгому контролю на соответствие спецификации по распределению по размеру частиц, размеру пор, объему пор и удельной поверхности. После получения каждая партия исходной матрицы модифицируется различными лигандами для получения различных модифицированных фаз. Каждый приготовленный лот модифицированного сорбента опять подвергается испытанию на соответствие таким специфическим параметрам, как плотность прививки лигандов, удерживание тестовых соединений, селективность и т.д.
Колонны TSKgel предназначены для общих методик ВЭЖХ или быстрой ВЭЖХ (FPLC). На них не распространяются гарантии, если они используются для каких-либо специфических приложений. Пригодность колонны для конкретного приложения определяется самим пользователем. GLP требует, чтобы при разработке надежного метода были испытаны как минимум три различные партии сорбента, чтобы оценить характер отклонений в удерживании и селективности, который может наблюдаться для колонн из других партий.
Tosoh Bioscience рекомендует, чтобы после получения был проверен внешний вид колонны, наличие инспекционного сертификата (Inspection Data sheet) и сертификата с условиями и данными испытаний (Operating Conditions and Specifications, OCS). В случае соответствия содержимого посылки, колонна должна быть проверена в соответствии с условиями, приведенными в инспекционном сертификате на соответствие спецификации, представленной в OCS.
УСТРАНЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПРОБЛЕМ, ВОЗНИКАЮЩИХ ПРИ РАБОТЕ С КОЛОННОЙ
Ниже перечислены 5 наиболее часто встречающихся проблем, приводящих к ухудшению эффективности колонны, и необходимые меры предосторожности.
1. Свободный объем на входе в колонну или появление каналов в упакованном слое.
Внезапное повышение давления и превышение рекомендуемого максимального значения могут вызывать сжатие упакованного слоя, из-за чего появляется свободное пространство на входе в колонну или каналы в упакованном слое, особенно в случае использования крупнопористых сорбентов типа TSKgel G4000SW и TSKgel G4000SWXL. Рекомендуется использовать инжектор, обеспечивающий непрерывный поток элюента во время введения пробы в колонну без скачков давления и остановки подачи элюента. Кроме того, рекомендуется установить демпфер, чтобы сглаживать скачки давления при использовании насосов с быстро-возвратным движением поршня.
Для некоторых типов аналитических и полупрепаративных колонн предлагаются небольшие количества неупакованного сорбента, которым можно заполнить возникшее пустое пространство.
Рекомендуется использовать предколонки для защиты Вашей аналитической колонны от скачков давления и необратимо сорбирующихся примесей. Предколонка помогает нейтрализовать рН пробы, если он отличается от рН элюента. рН пробы в этом случае будет уравновешен с подвижной фазой прежде, чем проба достигнет аналитической колонны. Это особенно важно для силикагелевых колонн серии SW,поскольку они нестабильны при рН выше 7.5.
2. Воздух в колонне
Колонна должна быть плотно закрыта, если она не находится в работе. Воздух, растворенный в подвижной фазе, должен быть удален из нее до того, как он попадет в колонну. Это особенно важно для полимерных колонн. Воздух можно удалить из элюента пропусканием гелия, вакууммированием или другими известными методиками дегазации. Если воздух все же попал в колонну, следуйте регидратационной процедуре.
3. Загрязнение колонны или неполное обнаружение
Процедуры очистки для каждого типа колонн приведены в сертификате OCS, которым снабжается каждая колонна. Растворители (растворы) для очистки обсуждаются в соответствующем разделе далее.
4. Засорения фритта и высокое давление
Проба и элюенты должны быть отфильтрованы через фильтр с пористостью не выше 0.45 мкм, чтобы избежать засорения фриттов. Если фритт частично засорен, то это может привести к расщеплению пиков или повышению давления. Входной фитинг можно снять с колонны и очистить обработкой ультразвуком в 6 М азотной кислоте. Надо соблюдать осторожность при снятии фитинга и не нарушать слой упакованного сорбента. Фитинг после очистки надо тщательно промыть от остатков кислоты. Также можно заменить фитинг на новый. Рекомендуется также установить мембранный фильтр перед инжектором для избежания попадания частиц от уплотнений поршня насоса в колонну.
5. Расщепление пиков
Концентрационная или объемная перегрузка колонны может приводить к расщеплению пиков и плохому разрешению. Чтобы определить допустимую концентрацию и объем пробы ознакомьтесь с информацией о емкости используемого сорбента.
ОЧИСТКА
Колонны необходимо чистить через регулярные интервалы времени, продолжительность которых зависит от чистоты пробы. Если один из параметров, характеризующих качество колонны, изменился более чем на 10%, то рекомендуется очистить колонну.
Инспекционный сертификат и сертификат OCS прикладываются ко всем колоннам TSKgel, в которых указан метод, использованный для определения качества колонны и характеристики колонны. Для контроля колонны сначала установите, что она работает нормально, используя стандартную тестовую смесь. Затем рассчитайте фактор асимметрии, число тарелок и разрешение одного или нескольких компонентов пробы. Запомните время удержания. Эти компоненты составят «новую тестовую смесь» для контроля качества колонны.
Базовые правила очистки всех типов колонн TSKgel
- Очищайте колонну, используя направление потока, обратное рабочему.
- Отсоедините колонну во время очистки от детектора.
- Очищайте колонну при потоке не выше половины от максимально допустимого и контролируйте давление.
- Если для очистки колонны используются растворы с высоким или низким значением рН, убедитесь, что остальные части хроматографической системы (насос, инжектор и т.д.) совместимы с этими растворами.
- Пропустите через колонну по меньшей мере 5 колоночных объемов (КО) каждого из очищающих растворов и промывайте ее 5 колоночный объем деионизированной воды перед каждым новым раствором.
- Промойте колонну перед началом ее использования 5 колоночный объем подвижной фазы.
Каждый тип колонн TSKgel имеет определенный набор растворов для очистки, как это описано ниже и в OCS. Выберите раствор для очистки исходя из типа используемой колонны и типа разделяемой пробы. В общем случае кислые очищающие растворы будут удалять основные белки, а органические растворители – гидрофобные примеси. Хаотропные реагенты удаляют сильно сорбирующиеся соединения (напр. связанные водородными связями). Для очистки типов колонн, которые не приведены ниже, обратитесь к нашим техническим специалистам.
РАСТВОРЫ ДЛЯ ОЧИСТКИ
Эксклюзионная хроматография, типы TSKgel SW и SWXL
- Концентрированные растворы солей (напр. 0.5 М Na2SO4) при низком рН (напр. рН 3.0).
- Смешивающиеся с водой органические растворители (метанол, ацетонитрил, этанол 10-20%) в водном буфере.
- Буферные растворы додецилсульфата натрия (0.1%), моче- вины (8 М) или гуанидина (6 М).
Примечание: хаотропные реагенты трудно удалить. Они требуют промывки 20-40 колоночный объем 20% ацетонитрила. Поэтому их следует применять только тогда, когда неэффективны другие растворы.
Эксклюзионная хроматография, типы TSKgel PW и PWXL
- Концентрированные растворы солей (напр. 0.5-1.0 М Na2SO4) в водном буфере.
- Буферные растворы при низком рН (напр. 2-3) или при высоком рН (напр. 11-12).
- Смешивающиеся с водой органические растворители (метанол, ацетонитрил, этанол 10-20%) в водном буфере.
- Буферные растворы додецилсульфата натрия (0.1%), мочевины (8 М) или гуанидина (6 М).
Примечание: хаотропные реагенты трудно удалить. Они требуют промывки 20-40 колоночный объем 20% ацетонитрила. Поэтому их следует применять только тогда, когда неэффективны другие растворы.
ИОХ, типы TSKgel SW
- Концентрированные растворы солей (напр. 0.5-1.0 М) в водном буфере.
- Буферные растворы с низким рН (напр. 2-3).
- Смешивающиеся с водой органические растворители (метанол, ацетонитрил, этанол 10-20%) в водном буфере
- Буферные растворы додецилсульфата натрия (0.1%), мочевины (8 М) или гуанидина (6 М).
Примечание: хаотропные реагенты трудно удалить. Они требуют промывки 20-40 колоночный объем 20% ацетонитрила. Поэтому их следует применять только тогда, когда неэффективны другие растворы.
ИОХ, типы TSKgel PW
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 0.1-0.2 М NaOH, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем щелочи
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 20-40% уксусной кислоты, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем кислоты. Поскольку кислота может вызывать осаждение белков, это метод очистки следует применять после других методов.
- Смешивающиеся с водой органические растворители (метанол, ацетонитрил, этанол 10-20%) в водном буфере.
- Мочевина (8 М) или неионный ПАВ в буферном растворе.
Примечание: см. примечание по использованию хаотропных агентов, представленное выше. Примечание: промойте ионообменную колонну 5 колоночный объем соответствующего раствора для восстановления правильного противоиона перед уравновешиванием колонны буфером пробы.
Гиброфобное взаимодействие, тип TSKgel PW
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 0.1-0.2 М NaOH, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем щелочи
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 20-40% уксусной кислоты, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем кислоты. Поскольку кислота может вызывать осаждение белков, это метод очистки следует применять после других методов.
Обращенные фазы, тип SW
- 100% ацетонитрил или метанол.
- Градиент от 10 до 100% ацетонитрила в 0.05% трифторуксусной кислоте.
Обращенные фазы, тип PW
- 100% ацетонитрил или метанол.
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 0.1-0.2 М NAOH, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем щелочи.
- Пропустите через аналитическую колонну 1 колоночный объем раствора 20-40% уксусной кислоты, вводя его порциями по 250 мкл. Через полупрепаративную колонну пропустите соответственно больший объем кислоты
HILIC, тип SW
- Вода.
- 45% ацетонитрила или ацетон.
- 0.1% триэтаноламин в водном ацетонитриле (концентрация ацетонитрила не ниже 75%).
- 50 мМ фосфатный буфер рН 6.0 в 50% ацетонитриле
Аффинная хроматография, тип PW
Смотрите OCS для специальных колонн с описанием процедуры очистки.
Защита колонки, регидратация и хранение
Защита колонки
GLP требует, чтобы разделяющая колонна была защищена предохранительной колонкой (предколонкой). Tosoh Bioscience выпускает богатый ассортимент предколонок и наборов для предколонок Guardgel. Набор Guardgel содержит пустую предколонку и сорбент для ее наполнения. Для тех колонн, для которых не предлагаются предколонки, Tosoh Bioscience рекомендует использовать встроенный фильтр с пористостью 0.5 мкм, чтобы предотвратить частое закупоривание фритт этих колонн, имеющих пористость 1 мкм. Также рекомендуется использовать мембранный фильтр перед инжектором для предохранения колонны от попадания частиц из уплотнений поршней насоса.
РЕГИДРАТАЦИЯ
Регидратация колонн TSKgel может происходить в результате длительного хранения или неправильного использования. Иногда случается так, что заглушки, которыми снабжаются колонны TSKgel, могут быть негерметично завинчены, что со временем приводит к высыханию колонны. Дегидратацию легче обнаружить на стеклянной колонне, поскольку сухой сорбент будет выглядеть отслоившимся от стенок колонны.
-
Ситуация может быть исправлена следующим образом:
- Подсоедините колонну к Вашей хроматографической системе в обратном направлении.
- Не подсоединяйте колонну к детектору.
- Закачивайте в колонну фильтрованный раствор 20% метанола в деионизированной воде при половинной скорости потока от максимально допустимого для данной колонны. Примечание: в случае ОФ колонн используйте 60% метанол.
- Продолжайте прокачивать элюент до тех пор, пока не убедитесь, что колонна регидратирована.
- Присоедините колонну к Вашей хроматографической системе в рабочем направлении.
- Промойте колонну 3 КО чистой воды для удаления следов органического растворителя, если он не является составной частью Вашего рабочего элюента.
- Уравновесьте колонну с загрузочным буфером для Вашей пробы.
- Проведите рекомендованный QC-тест, чтобы убедиться, что колонна работает нормально. Методы оценки могут быть получены от технического отдела Tosoh Bioscience.
ХРАНЕНИЕ КОЛОННЫ
Если колонна будет использоваться на следующий день, то прокачивайте через нее на низкой скорости элюент, который не содержит галогенид-анионов. Если колонна не будет использоваться больше, чем один день, то, прежде всего, очистите колонну, вымойте из нее соли, и заполните колонну 0.05% азида натрия в 20% этаноле. После этого отсоедините колонну и герметично закройте ее заглушками, чтобы предохранить от высыхания.
МАСШТАБИРОВАНИЕ
Эксклюзионная хроматография
Tosoh Bioscience предлагает полупрепаративные (21.5 мм), препаративные (55 мм) и большего диаметра стальные колонны, упакованные сорбентами TSKgel PW или SW, для беспроблемного масштабирования к промышленному разделению терапевтических белков и других биофармсоединений.
Эти сорбенты имеют больший размер частиц, поскольку предназначены для работы с промышленным оборудованием. В то же время эти сорбенты имеют тот же самый размер пор и обеспечивают ту же самую селективность, что и сорбенты TSKgel в аналитических колоннах. Объем препаративной колонны (ОПК), который необходим для обеспечения требуемого количества продукта (на 1 ввод пробы) рассчитывается по формуле:
(ОК)преп / (ОК)аналит = (мг продукта)преп / (мг продукта)аналит
где преп. и аналит. относятся к препаративной и аналитической колоннам, соответственно. Объем колонны вычисляется при помощи соотношения π(ID)2L/4, где ID – внутренний диаметр колонны, L – длина колонны. При масштабировании процесса длина колонны как правило остается постоянной. При этот условии для достижения 100-кратного увеличения выхода продукта за 1 разделение внутренний диаметр препаративной колонны должен быть в 10 раз больше диаметра аналитической колонны. Как отмечалось выше, препаративные колонны обычно упаковываются сорбентами с большим размером частиц, и, кроме того, они должны быть большего диаметра, как это следует из приведенного уравнения. Мнемоническое правило говорит, что двукратное увеличение размера частиц понижает разрешение и, следовательно, выход продукта в √2 раз.
Поскольку масштабирование от аналитической колонны сравнительно несложно, то препаративные колонны TSKgel могут представлять собой экономичный путь для быстрого получения биосоединений для клинических испытаний. Для более детальной оценки Ваших потребностей при масштабировании процесса обратитесь к нашим техническим специалистам Tosoh Bioscience.
Ионообменная хроматография и ХГВ
Tosoh Bioscience предлагает препаративные колонны различного диаметра для ИОХ и ХГВ. В отличие от эксклюзионной хроматографии, где колонны имеют обычно длину 30 и 60 см, препаративные колонны для ИОХ и ХГВ предлагают- ся длиной 20 см. Как было показано выше, для расчета ёмкости большой колонны необходимо умножить ёмкость колонны диаметром 7.5 мм на соотношение объемов колонн. Таблица, приведенная ниже, перечисляет объемы колонн для ИОХ и ХГВ и отношение этих объемов к объему колонны размером 7.5 мм×7.5 см:
| РАЗМЕРЫ ( мм× см) |
Объем (мл) |
Отношение объемов (относительно колонны 7.5 мм×7.5 см.) |
|---|---|---|
| 5×5 | 1.0 | 0.3 |
| 7.5×7.5 | 3.3 | 1.0 |
| 8.0×7.5 | 3.8 | 1.2 |
| 20×15 | 47.1 | 14.3 |
| 21.5×15 | 54.4 | 16.4 |
| 55×20 | 474.9 | 143.6 |
| 108×20 | 1831.2 | 554.8 |
Если емкость колонны 7.5 мм×7.5 см составила 1 мг продукта, то ёмкость колонны 55 мм×20 см будет около 150 мг. На колонну обычно можно вводить большие количества сырой пробы, поскольку примеси элюируются с колонны отдельно от целевого продукта.
СТАНДАРНЫЕ ВЕЩЕСТВА, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА КОЛОНН TSKGEL
| Стандарт | Приблизительная* молекулярная масса (Да) |
|---|---|
| Аденитлаткиназа | 6,000 |
| Алкогольдегидрогеназа | 150,000 |
| Альдолаза | 158,000 |
| В-амилаза | 200,000 |
| Голубой декстран | 2,000,000 |
| Бомбензин | 1,620 |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | 67,000 |
| Карбоангидраза | 29,000 |
| α-Химоприпсин | 25,200 |
| α-Химотрипсиноген | 25,700 |
| Кональбумин | 70,000 |
| Цитидин | 243 |
| Цитидин-5-монофосфат | 323 |
| Цитохром С | 12,400 |
| D-маннитол | 182 |
| Дофамин-HCl | 190 |
| Энолаза | 67,000 |
| Этиленгликоль | 62 |
| Ферретин | 460,000 |
| γ-Глобулин | 150,000 |
| Глутаматдегидрогеназа | 55,000 |
| Глицин | 246 |
| IgG | 160,000 |
| IgM | 900,000 |
| Инсулин | 6,000 |
| Лактатдегидрогеназа | 36,500 |
| Лизоцим | 14,500 |
| Миоглобин | 16,900 |
| Овальбумин | 43,000 |
| п-Аминобензойная кислота | 137 |
| Пероксидаза | 40,200 |
| Фосфорилаза В | 94,000 |
| Полиэтиленгликоли (набор) | 1.1K, 1.5K, 3.7K, 10.9K, 19.7K |
| Полиэтиленоксиды (набор) | 18K, 39K, 86K, 145, 252K, 594K, 996K |
| Полистиролы (набор) | 530, 950, 2.8K, 6.2K, 10.3K, 15.7K, 43.9K, 102K, 186K, 422K, 775K, 1260K |
| Пируваткиназа | 58,000 |
| Рибонуклеаза А | 12,600 |
| Тиреоглобулин | 660,000 |
| Трансферрин | 80,000 |
| Трипсин | 23,300 |
| Ингибитор трипсина | 20,000 |
| Трипсиноген | 24,000 |
| Триптамин-HCl | 24,000 |
| Мочевая кислота | 168 |
*Точная молекулярная масса зависит от вещества.